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发光细菌在毒性试验的应用

作者 时间:2020-06-22 阅读次数:390

自然界中有一群会发出生物萤光 (Bioluminescence) 的细菌,统称为发光细菌 (Luminescent bacteria),除了少数像与线虫共生的陆生发光异短桿菌 (Xenorhabdus luminescens)、淡水的霍乱弧菌 (Vibrio cholerae) 外,它们大多数生活于海洋中,可于海洋生物的体表、或共生于海洋生物的消化道或发光器官中发现,常见的几种海洋发光细菌有费氏弧菌 (Vibrio fischeri)、明亮发光桿菌 (Photobacterium phosphoreum)、哈维氏弧菌 (Vibrio harveyi) 等。

虽然发光细菌种类甚多,但生理特性都非常相似、也用相同的原理发光。在它们生长代谢的过程中,会利用本身之萤光素酶 (Luciferase) 和氧分子催化还原态黄素单核酸 (FMNH2) 和长鍊脂肪醛 (RCHO),分别氧化为氧化态黄素单核酸 (FMN) 和长鍊脂肪酸 (RCOOH) 进行产能反应,而释放出的能量会以最大发光强度在波长 450 – 490 nm 的蓝绿萤光形式表现,即上述的生物萤光。发光的反应过程相当複杂,简化过程如下式与图一,其中灰底三式之中间产物存续时间极短,很难加以分离出来。

发光细菌在毒性试验的应用

发光细菌在毒性试验的应用

图一、一般发光细菌 (Luminescent bacteria) 的生化反应简图(本文作者张淳淳绘)

发光细菌在正常的生理条件之下发光强度是稳定且持续的,但一旦受周遭环境影响、比如暴露在污染物之下时,它们的发光程度可能由于萤光素酶活性降低或是其他与发光反应的相关的代谢反应受到抑制,造成发光量减少,而此通常会在一定範围内呈高度相关,因此我们可藉由对发光强度的量测推估环境中污染物对细菌的毒性。

在诸多以发光细菌作为受试对象的毒性检测方法中,由美国 Modern Water 公司持有专利的 Microtox® 快速毒性检测 (Microtox® rapid toxicity detection) 是其中最为所知且广泛利用者,其他还有 HACH 公司的 LUMISTOX 发光细菌检测 (LUMISTOX Luminescent bacteria test) 与 ToxAlert 公司开发出的诸多气体检测方法等。

以 Microtox® 快速毒性检测为例,其为一套以费氏弧菌当作试验生物的毒性检测系统,试验架构是先把待测样品注入菌液一起培养,接着视样本性质进行过滤后,将液态之样品与细菌混合液加入比色管 (Cuvette) 并放上萤光仪分析。其萤光量的改变通常用 $$\Gamma~\text{(Gamma)}$$ 值来表示,计算式如下。

发光细菌在毒性试验的应用

举例来说,整个实验进行时间共为 $$30$$ 分钟,$$\Gamma$$ 的计算就是以 $$0$$ 分钟的初始萤光量减去 $$30$$ 分钟之萤光量、再除以结束时间点萤光量所求得之比值,可以呈现出目标污染物或是该系统环境毒性的程度,其 $$\Gamma$$ 萤光量减少的程度较为剧烈,因此浓度或毒性可能越强;而若 $$\Gamma$$ 越小则反之。

除了用 $$\Gamma$$ 表示外,也可以换算成半最大效应浓度 $$\mathrm{EC_{50}}$$ (Half maximal effective concentration) 来表示,如下图二所示,在找出浓度与 $$\Gamma$$ 的线性关係后(橘框处公式),可以用 $$\Gamma=1$$ 带入方程式求出对应的浓度、即为 $$\mathrm{EC_{50}}$$。$$\mathrm{EC_{50}}$$ 在毒理学 (Toxicology) 上是一常用的单位,可以使得 Microtox® 检测法的数据更有比较性及代表性。

发光细菌在毒性试验的应用

图二、Microtox® 快速毒性检测中的 $$\Gamma$$ 值与浓度之关係示意图(本文作者张淳淳绘)

比起使用其他试验生物的毒性检测,使用发光细菌的诸方法都有试验材料易于购置、反应时间短、操作简单与成本经济等特性,因此包括国际标準化组织 ISO (International Organization for Standardization)、德国标準化学会 DIN (Deutsches Institut für Normung e.V.)、美国材料与试验协会 ASTM (American Society for Testing and Materials) 等皆将发光细菌毒性检测列入标準检测方法,广泛应用于水质、空气、土壤及底泥等环境中的污染监测中。


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